miRNA定量檢測的*

 　　所謂miRNA定量檢測就是對已經(jīng)獲得的目的DNA片段進(jìn)行重新克隆，其目的在于對目的DNA進(jìn)行進(jìn)一步分析，或者進(jìn)行重組改造等。miRNA定量檢測的基本過程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；(4)重組子篩選。
　　選擇適宜的限制性核酸內(nèi)切酶，消化已知目的DNA和載體，獲得線性DNA，用于重組。根據(jù)目的DNA和載體的具體情況，選擇一種或者兩種適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈?，分別產(chǎn)生對稱性粘性末端（用一種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有互補(bǔ)突出端）、不對稱粘性末端（用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)突出端）、平端。在miRNA定量檢測時(shí)，不對稱相容末端連接，次選對稱性粘性相容性末端連接，由于平末端連接效率較低，通常很少采用。但有時(shí)目的片段的末端與載體不匹配 ，一般先將不匹配末端補(bǔ)平，然后再以平末端連接。
　　miRNA定量檢測實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
　　（一）定量檢測實(shí)驗(yàn)對照設(shè)置
　　為使miRNA定量檢測實(shí)驗(yàn)成功，并能在未獲得目的克隆時(shí)，查明實(shí)驗(yàn)失敗的原因，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)包括相應(yīng)的對照。其中包括感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率、抗菌素是否有效、連接的效率、未連接質(zhì)粒的背景、磷酸酶處理的效果等。
　?。ǘ?span style="font-size: 12px;">miRNA定量檢測檢測連接反應(yīng)的效果的對照實(shí)驗(yàn)
　　為檢測連接反應(yīng)的效果，線化（單限制性酶切，非磷酸酶處理）質(zhì)粒需同實(shí)驗(yàn)樣品平行連接。取一部份連接反應(yīng)液用于轉(zhuǎn)化，隨后涂布到選擇培養(yǎng)基上。平板上所生長的菌落數(shù)，可同相同量、未連接的線化質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化相同數(shù)目的細(xì)菌后，涂布在選擇培養(yǎng)基上所生長的菌落數(shù)比較。如果連接成功，自連接質(zhì)粒在平板上的菌落數(shù)，miRNA定量檢測會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未連接的線化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌所得的菌落數(shù)。如果線化成功，未連接的線化質(zhì)粒（未連接的質(zhì)粒背景）所得的菌落數(shù)應(yīng)很低。如miRNA定量檢測連接效率高，則自連質(zhì)粒所得的菌落數(shù)應(yīng)同用完整質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌所得的菌落數(shù)相近。 另一種非定量的方法是將等量的未連接質(zhì)粒和連接質(zhì)粒在瓊脂上電泳，連接后的樣品的遷移率會降低。
　?。ㄈ?span style="font-size: 12px;">miRNA定量檢測連接實(shí)驗(yàn)需要優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)
　　1、載體和插入片段的摩爾濃度比特別重要，載體:插入片段的摩爾數(shù)的變化范圍可為8:1到1:16，但通常的變化范圍是3:1到1:3。插入片段的長度和序列的變化會影響和同一載體的連接效果。每一個(gè)連接反應(yīng)都需要作實(shí)驗(yàn)，來選擇*的載體和插入片段的摩爾數(shù)比。在zui小的反應(yīng)體積中，通常一個(gè)連接反應(yīng)用10~50 ng的載體DNA。
　　2、進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)的保溫的時(shí)間和溫度也需優(yōu)化。一般而言，平末端連接在22℃保溫4~16小時(shí)，粘性末端在22℃保溫3小時(shí)，或4℃保溫16小時(shí)。大多數(shù)連接反應(yīng)用miRNA定量檢測連接酶，但大腸桿菌的DNA連接酶可用于粘性末端的連接，平末端連接時(shí)用此酶，活力較低。每次連接反應(yīng)用1~10 Weiss單位的高質(zhì)量連接酶。
　　3、用于轉(zhuǎn)化連接反應(yīng)液的細(xì)菌菌株，以及用于重組質(zhì)粒擴(kuò)增的菌株，需經(jīng)挑選，細(xì)菌生長的溫度也要挑選。當(dāng)用pGEM載體克隆大片段時(shí)（>7~8 kb），經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株在30℃而不是在37℃生長，更有利于連接。作簡單的miRNA定量檢測連接實(shí)驗(yàn)，定量檢測轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞就可滿足克隆需要，更高轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞可用于作比較困難的克隆實(shí)驗(yàn)。為提高獲得目的克隆的機(jī)會，應(yīng)用盡可能高轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞（>108克隆/ugDNA）。 篩選重組克隆時(shí)，需選擇抗菌素的濃度。
　　不同廠家生產(chǎn)的miRNA定量檢測連接酶反應(yīng)條件稍有不同，但其產(chǎn)品說明書上均有zui適反應(yīng)條件，包括對不同末端性質(zhì)DNA分子連接的miRNA定量檢測連接酶的用量、作用溫度、時(shí)間等。同時(shí)提供有連接酶緩沖液（10×、5×、2×），其中多已含有要求濃度的ATP，應(yīng)避免高溫放置和反復(fù)凍融使其分解。目的DNA片段制備、回收、純化時(shí)，應(yīng)避免外來DNA污染。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：miRNA定量檢測細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)特殊試劑處理后在適當(dāng)?shù)臈l件下具有接收外源DNA的能力，因此可將上述連接產(chǎn)物通過熱刺激或電脈沖轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)菌大量增殖的同時(shí)，導(dǎo)入的重組DNA也得到增殖。miRNA定量檢測態(tài)細(xì)胞所用離心管、培養(yǎng)瓶經(jīng)酸堿處理或使用新的，15 lbf/in2高壓滅菌20min。白色菌落中重組質(zhì)粒內(nèi)插入片段是否是目的片段需通過鑒定。